SIAH1介导TRB3的泛素化和降解.pdf

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医学分子生物学杂志，201l，8 1 ：7-10 JMedMolBiol，2011，8 1 ：7-10 DOI：10．3870／j．issn．1672—8009．2011．01．OO2 SIAH1介导 TRB3的泛素化和降解 周颖 ，侯树勋。，张令强 中国人民解放军总医院第一附属医院全军骨科研究所 北京市，100048 北京放射与辐射医学研究所 北京市，100850 【摘要】 目的 利用酵母回转实验和免疫共沉淀实验验证SIAHI和TRB3之间的相互作用并探讨其功能 相关性。方法 将全长形式的TRB3基因和SIAH1基因分别克隆入酵母表达载体pDBLeu和pPC86中，共转 化至MaV203酵母感受态细胞，验证其相互作用，然后分别构建至真核表达载体pCMV—Myc和pFLAG—CMV一 2中，采用免疫共沉淀实验进行进一步验证。通过体内泛素化实验检测 SIAH1对TRB3蛋白稳定性及泛素 化修饰的影响。结果 通过在酵母细胞中的回转实验和HEK293rr细胞中的免疫共沉淀实验证实了TRB3与 SIAH1之问的相互作用。通过体内泛素化实验证实了S1AH1介导了TRB3的泛素化修饰和降解。结论 证 实了TRB3与SIAH1之间的相互作用并发现 SIAH1介导了TRB3的泛素化修饰和降解，为TRB3蛋 白的功能 研究提供了新的线索。 【关键词】 蛋白一蛋白相互作用；TRB3；SIAH1；泛素一蛋白酶体途径 【中图分类号】 Q71 SIAH1M ediatedUbiquitinatiOn andDegradation ofTRB3 ZHOU Ying ， HOU Shuxun ，ZHANG Lingqiang InstituteofOrthopadics，the AffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital，Beijing，100048， China BeijingInstituteofRadiationMedicine，Beijing，100850，China 【Abstract】 objective TovalidatetheinteractionbetweenSIAH1andTRB3andexploretheir functionalrelationship．Methods FulllengthTRB3andSIAHlwele·sub—clonedintoyeastexpres sionvectorspDBLeuandpPC86respectively．and thenCO．transofnnedintoMaV203forretransofr mationtest．Inaddition．MammalianexpressionvectorsexpressingrespectiveTRB3andSIAH1were consturcted．Interaction ofTRB3 and SIAH1 wasdetected by CO。immunoprecipitation assay．The effectsofoverexpressedSIAHlon TRB3 stability andubiquitinationwereinvestigatedby in—vivo ubiquitination assay．Results SIAH1wasassociated with TRB3 in both yeastand mammalian cells．Importantly．SIAH1targetedTRB3ofrproteasome—dependentdegradation．Conclusion SIAHl mediatedubiqutinationanddegradationofTRB3．suggestiveofrfurtherfunctionalstudyofTRB3． 【Keywords】 protein—proteininteraction；TRB3；SIAH1；ubiquitin—proteasomepathway TRB3 tribbles3homolog 是近年来发现的一 gen，CA 筛选人肝脏 cDNA文库，寻找其相互作 个脚手架蛋 白，在包括胰岛素信号通路 、NF．．cB 用蛋 白，发现有两个克隆独立编码泛素连接酶 SI 信号通路 、BMP信号通路 和脂代谢 等在内 AHI[seveninabsentiahomolog1 drosophila ]蛋 的多种生理过程中发挥着重要作用 。我们在前期的 白的第 63～282位氨基酸之 间的区段 GenBank 研究中，采用ProQuestTM酵母双杂交系统 Invitro． 登录号 N